产品目录

本制品是用于Illumina/MGI测序平台的RNA测序文库的cDNA合成试剂盒，包含高效RNA反转录试剂，常规ds-cDNA合成试剂。可衔接Hiper NGS OnePot cDNA&gDNA Library Prep Kit（货号：SY0835）进行后续建库。本试剂盒提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

• DNA纯化磁珠：Hiper NGS DNA Selection Beads或AMPure XP Beads（A63880）或其他等效产品。
  
• 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。
  
• 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
  
• 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
  
• 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZap高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
  
• PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZap高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。
  
• 本制品仅作科研用途！

• RNA变性
  
  • 将Random Primer室温解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。按照下表配置反应液：
    表1．RNA预变性反应体系
    

    成分	用量
    Random Primer	1μL
    RNA	14μL
    总体积	15μL

    
    
  • 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
    
  • 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表2所示设置反应程序，进行RNA的预变性。
    表2．RNA预变性反应程序
    

    温度	时间
    热盖75℃	On
    70℃	5min
    立即置于冰上	3min

• 第一链cDNA的合成
  
  • 将第一链合成试剂从-20℃取出，室温解冻，颠倒混匀后瞬离。按表3所示，配制第一链cDNA合成的反应液。
    表3．第一链cDNA合成反应体系
    

    成分	用量
    变性的RNA	15μL
    1st Reaction Buffer	8μL
    1st Srtand Enzyme Mix	2μL
    总体积	25μL

    
    
  • 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
    
  • 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表4所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。
    表4．第一链cDNA合成反应程序
    

    温度	时间
    热盖105℃	On
    25℃	5min
    42℃	30min
    85℃	5min
    4℃	Hold

• 第二链cDNA的合成：
  
  • 将第二链合成试剂从-20℃取出，解冻后颠倒混匀；按照表5所示，配制第二链cDNA合成反应液。
    表5．第二链cDNA合成反应体系
    

    成分	用量
    1st Strand cDNA	25μL
    2nd Reaction Buffer	7μL
    2nd Strand Enzyme Mix	3μL
    总体积	35μL

    
    
  • 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
    
  • 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表6所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。
    表6．第二链cDNA合成反应程序
    

    温度	时间
    热盖	Off
    16℃	5min
    4℃	Hold

• 第二链cDNA产物可衔接Hiper NGS OnePot cDNA&gDNA Library Prep Kit（货号：SY0835）进行后续建库。